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一种由谷胱甘肽过氧化物酶克隆该基因的方法  
 【申请号】  CN201510008280.5  【申请日】  2015-01-08
 【公开号】  CN104561054A  【公开日】  2015-04-29
 【申请人】  东北农业大学  【地址】  150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区木材街59号
 【共同申请人】  
 【发明人】  刘慧民;刘计璇;王大庆;聂颖;苏青;房莉;仉茜;张娇;李小婷;刘冰冰
 【国际申请】    【国际公布】  
 【进入国家日期】  
 【专利代理机构】    【代理人】  
 【分案原申请号】  
 【国省代码】  23
 【摘要】  一种由谷胱甘肽过氧化物酶克隆编码该酶的基因的方法,涉及由园林植物华北绣线菊克隆谷胱甘肽过氧化物酶基因的方法。本发明通过鉴定的抗寒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶克隆抗寒基因,比传统的基因克隆方法具有更高的特异性和准确性。方法:一、提取绣线菊总RNA;二、设计简并引物;三、基因中间片段的克隆;四、基因3’RACE克隆;五、基因5’RACE克隆;六、序列拼接获得基因全长,即完成谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆。本发明方法所克隆出的谷胱甘肽过氧化物酶基因受低温诱导,表达量显著增加,因此具有增强绣线菊抗寒能力的功能,为提高绣线菊抗寒能力和培育绣线菊新品种奠定基础,可应用于绣线菊抗寒基因工程和分子育种领域。
 【主权项】  一种由谷胱甘肽过氧化物酶克隆该基因的方法,其特征在于由谷胱甘肽过氧化物酶克隆该基因的方法,按以下步骤进行:一、提取绣线菊总RNA;二、设计简并引物:根据谷胱甘肽过氧化物酶的氨基酸序列设计该基因中间片段的简并引物DP1、DP2;三、基因中间片段的克隆:采用反转录反应合成cDNA:20μl反转录反应体系由10μl的2×TS?Reaction?Mix、3μl的RNase?free?H||sub||2||/sub||O、1μl的Anchored?Oligo?(dT)、5μl的Total?RNA、1μl的TransScript?RT/RI?Enzyme?Mix组成,混合后放入PCR仪中进行反转录反应,再对合成产物进行PCR扩增反应:25μl扩增反应体系由2μl的cDNA、1μl的DP1引物、1μl的DP2引物、2.5μl的10×LA?PCR?Buffer、2.5μl的dNTP?Mixture、15.8μl的Autoclaved?distilled?water、0.2μl的LA?Taq?DNA?polymerase组成,反应结束后,取3μl?PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,回收PCR扩增产物,将回收产物与pMD19?T连接载体连接后转化大肠杆菌DH5α并保存,再进行中间片段阳性克隆培养及PCR扩增后选取与目标片段大小相近的片段回收测序并进行序列分析;四、基因3’RACE克隆:根据测序结果和正确的华北绣线菊谷胱甘肽过氧化物酶基因的中间片段设计3’RACE特异性引物GPX1、GPX2,10μl反转录反应体系为,4.5μl的RNase?Free?dH||sub||2||/sub||O,1μl的3’RACE?Adaptor,2μl的5×Prime?Script?Buffer,1μl的dNTP?Mixture,0.25μl的RNase?Inhibitor,0.25μl的Prime?Script?RTase,1μl的RNA,反转录反应后进行巢式PCR反应,回收PCR产物,以回收的3′RACE?PCR产物为模板进行连接,在进行3’RACE阳性克隆培养及PCR扩增后选取与目标片段大小相近的片段回收测序并进行序列分析;五、基因5’RACE克隆:根据测序得到的中间片段序列与3’RACE得到的基因片段序列设计5’RACE特异引物GPX3、GPX4,进行去磷酸化反应、去发夹结构反应和5’RACE加接头连接反应,进行5’RACE反转录产物的外侧PCR反应和内侧PCR反应,回收PCR产物,以回收的5′RACE?PCR产物为模板进行连接,在进行5’RACE阳性克隆培养及PCR扩增后选取与目标片段大小相近的片段回收测序并进行序列分析;六、基因全长序列的拼接:根据测序得到的目标基因的中间保守片段、3′端和5′端的序列在DNAMAN软件中拼接基因全序列,根据测序公司提供的碱基可信度进行全序列分析后,再根据已拼接的全长序列设计全长特异引物GPX5、GPX6,克隆全长基因,并将全长基因在NCBI上比对分析同源性,完成谷胱甘肽过氧化物酶全长基因的克隆;其中步骤二中DP1简并引物序列为TRGCATTCCCRTGYAAYCAG,DP2简并引物序列为AAAGATGGGRTAYTCAGC;步骤四中GPX1引物序列为TAGAAAGCCAGTCCGCAGAAA,GPX2引物序列为TGGACTCTTTGGTGACAGCATC;步骤五中GPX3引物序列为GATGCTGTCACCAAAGAGTCCA,GPX4引物序列为CAATCTCATCATTAGTTCCT;步骤六中GPX5引物序列为ACTGATGATCAGTCGATGGAACATGG,GPX6引物序列为GTCCGACATTACAAAGAAATACA。
 【页数】  9
 【主分类号】  C12N15/53
 【专利分类号】  C12N15/53;C12N15/10
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